编者按：基于细胞游离DNA（cfDNA）的液体活检被认为是极具前景的早期肝细胞癌（HCC）诊断方法。但由于一次抽血中获得的cfDNA产量有限，单次只能进行单个组学层面（如突变，甲基化等）的检测，限制了大多数样本的使用。中国医学科学院肿瘤医院细胞及分子生物研究室焦宇辰课题组、外科赵宏教授团队和免疫学研究室曲春枫课题组合作研发了“突变胶囊Plus（MCP）”技术，该技术可对一份cfDNA样本进行多重分析，包括同时检测突变和甲基化改变，以及在全基因组范围内发现新的甲基化标志物。研究表明，MCP技术具有发现和验证多组学生物标志物的潜力，适用于癌症的无创活检。《肿瘤瞭望》特此报道，以飨读者。

 

 

该研究成果于近日以Research Article形式发表于Science Translational Medicine杂志（IF=19）。国家分子肿瘤学重点实验室焦宇辰、曲春枫研究员和中国医学科学院肿瘤医院肝胆外科赵宏教授为论文的共同通讯作者。

 

 

晚期HCC的5年生存率仅为12%，通过早期发现从而及时手术切除是治疗HCC最有效的方法。因此，临床亟需一种能高精度地检测可切除的HCC的方法。基于cfDNA的液体活检技术就是一种可应用于临床的极具前景的无创诊断方法。此前研究已经确定了潜在的癌症诊断标志物，如体细胞突变、甲基化改变、cfDNA片段大小分布和cfDNA断点信息等。

 

在HCC的相关研究中，多项研究证实了通过检测cfDNA突变识别肝癌的有效性。然而，由于采样问题，检测含量较低的cfDNA的低频突变是困难的。DNA甲基化改变是癌症进展过程中最早发生的分子变化之一，异常的DNA甲基化改变，包括CpG岛（CGIs）的高甲基化，可能是包括HCC在内的几乎所有人类肿瘤类型的标志物。cfDNA甲基化检测可用于癌症的诊断、预后和监测。亚硫酸氢盐测序被认为是DNA甲基化分析的“金标准”；然而，该方法会造成大量的DNA损伤，降低cfDNA的可检测性进而影响检测灵敏度。

 

根据先前的研究，多组学生物标志物的组合分析，如甲基化、突变和蛋白标志物，可能提高癌症检测的性能。然而，大多数cfDNA检测技术单次只能检测一种类型的生物标志物，而一次抽血所含的cfDNA产量通常不足以支持多次检测。因此，既往大多数研究都只关注于一种类型的生物标志物，难以比较来自不同研究中不同队列的生物标志物的表现，也难以结合生物标志物来开发更好的癌症检测算法。

 

本研究开发的MCP技术，不仅支持突变和甲基化改变的并行分析，还能通过CpG串联靶扩增（CTTA）发现新的甲基化标志物。MCP技术在不牺牲灵敏度的情况下还实现了对单个cfDNA样本的多重检测。本研究将MCP技术应用于HCC的检测，通过不同队列进行训练和验证。

 

 

本研究利用MCP技术，对来自30例HCC病例和30例非HCC对照的cfDNA样本进行了甲基化标志物的从头筛选。在纳入的60例HCC和60例非HCC的训练队列中，通过突变和甲基化的平行分析，建立了HCC检测模型，并在纳入58例HCC和198例非HCC的独立回顾性队列中对此模型进行验证。进一步地，在311例经过肝脏超声检查且血清AFP水平正常的无症状HBsAg阳性的前瞻性队列的血液样本中验证了此HCC检测模型的潜在价值。

 

 

首先评估了MCP在突变检测中的性能。对标准参考样本进行MCP分析，将含有已知突变频率的标准品DNA（HD753）与健康人白细胞DNA进行掺比，一共分析了104份标准参考样本，不同突变频率（AF）（0.1%、0.05%、0.025%和0%）和DNA起始量下（5、10、20、40和100 ng）设置4-8个重复。在参考样本中，100 ng DNA起始时，0.1%、0.05%和0.025%突变频率下的检测灵敏度分别为100%、100%和97.5%。40 ng DNA起始时，0.1%、0.05%和0.025%突变频率下的检测灵敏度分别为100%、95%和73.8%（图1A）。野生型样本中未检测到候选突变（0%频率下特异性为100%）。此外，MCP技术对低起始量样本中的低频突变检测表现出很强的性能，0.1%突变频率下，10 ng起始量DNA的检测灵敏度为93.8%，5 ng起始量DNA的检测灵敏度67.5%。20 ng DNA起始量时，0.025%突变频率下的检测灵敏度为68.8%（图1A）。灵敏度提高的一个潜在原因是MCP支持在两个反应中从两个方向靶向突变，因此几乎所有的cfDNA分子都可以被扩增和测序。除单核苷酸变异突变外，MCP还能检测到长插入缺失（INDEL）等（图1A）。

 

此外，还对参考样本HD753 DNA进行了更多梯度突变频率下的分析（AF=0、0.025、0.050、0.125、0.250、1.00和5.00%），以进一步确定MCP在检测突变方面的性能。数据显示，通过MCP分析得到的预期突变频率与观察到的突变频率之间呈强线性相关（R²=0.96，P<2.2×10^-16；图1B）。将两个热点突变（EGFR-p.G719S和BRAF-p.V600E）的数字液滴PCR的检测结果与MCP的分析结果进行比较，两种方法表现出较高的相关性（R²=0.95，P=5.8×10-8；图1C）。

 

许多基于cfDNA进行癌症液体活检的研究都是采用杂交捕获的方法，接着将MCP与之进行比较，结果表现出很强的一致性，包括一些低频突变的检测（R²=0.98，P<2.2×10^-16；图1D）。这些结果进一步证实了MCP技术在突变检测方面的准确性。

 

 

为验证MCP检测甲基化的性能，将完全甲基化的人基因组（FMG）DNA加入非甲基化的人基因组（NMG）DNA中，制备了不同甲基化频率下的24个标准参考样本（25%、10%、1%和0%），并进行MCP分析。结果显示，预期甲基化频率与MCP获得的甲基化频率呈线性相关（R²=0.99，P<2.2×10^-16）。在所有24个检测到的甲基化位点，1%FMG稀释样本显示的甲基化显著高于0%样本（NMG DNA）（P<0.0001，Wilcoxon检验），表明MCP可以检测到低至1%频率下的甲基化。

 

此外作者还将MCP与两种常见的基于重亚硫酸盐转化的方法（qPCR及靶向捕获测序）进行了比较（图1F，G），进一步证实了MCP技术在检测甲基化方面的可靠性。

 

图1.MCP在突变和甲基化检测中的性能分析

（引自发表文章）

 

 

研究者对一份MCP前文库的等分试样再现原始cfDNA的能力进行测试，以确保MCP技术能够支持对同一份样本的多重分析。研究者比较了来自同一个cfDNA样本的前MCP文库中的3个重复，其中每个重复中使用了10%的前MCP文库。通过分析一组TP53和TERT突变及21个甲基化位点，所有3个重复之间的检测结果高度一致（图2A）。

 

此外，还使用UID跟踪原始cfDNA分子。MCP的3个重复中鉴定的UID个数在很大程度上重叠，76%的UID家族在3个重复中都能被检测到（图2B）。在这种情况下，一份（10%）MCP文库可以代表大多数原始cfDNA分子（图2B）。进一步，对相同起始量的cfDNA分子在不制备前MCP文库的情况下，通过接头连接后直接进行突变/甲基化的靶向扩增进而得到MCP文库。结果显示，由连接产物得到的MCP文库所捕获到的UID数目与10%的前MCP文库得到的UID数目相当（图2C和D）。

 

因此，10%的前MCP文库足以进行基因组变异的分析，且检测性能不受影响。

 

图2.同一个MCP前文库多次重复检测的性能

（引自发表文章）

 

 

利用突变及甲基化联合生物标志物建立了HCC检测模型：①HCC患者cfDNA中特异性高甲基化标志物；②HCC肿瘤中普遍存在的突变，包括TP53、CTNNB1和TERT突变，以及HBV整合。

 

共纳入148例HBV相关的HCC患者和288例非HCC的HBV病毒携带者。为了发现HCC甲基化标志物，首先对30例HCC和30例非HCC进行分析，筛选出了56个甲基化标志物。结合既往研究报道的对HCC有诊断价值的22种甲基化生物标志物，最终选择了64个甲基化标志物。60个HCC样本和60个非HCC样本被分配到训练集，通过随机森林算法最终鉴定出10个在HCC与非HCC对照中差异性高甲基化标志物。

 

最后，研究者构建了一个突变和甲基化标志物联合检测HCC的模型，该HCC检测模型在训练集中的AUC值为0.96（95%CI：0.93～1.00；图3A），灵敏度为93%（95%CI：0.84～0.98），特异性为95%（95%CI：0.86～0.99；图3B和C）。

 

 

接着纳入了58例HCC和198例非HCC作为独立队列来验证HCC检测模型的性能。分析显示，该模型检测HCC的灵敏度为90%（95%CI：0.79～0.96），特异性为94%（95%CI:0.90～0.970，AUC值为0.93（95%CI：0.88～0.98；图3B至D）。

 

研究者还分别研究了甲基化和突变标志物的性能。HCC与非HCC的甲基化水平表现出差异性（图3E）。在基于甲基化评分的ROC曲线分析中，AUC值为0.78（95%CI：0.70～0.87；图3D），灵敏度为64%（95%CI：0.50～0.76），特异性为95%（95%CI：0.91～0.98；图3B和C）。HCC的甲基化得分显著高于非HCC（P<0.0001，单尾Mann-Whitney检验；图3F）。此外，甲基化得分随肿瘤大小增加而增加（图3G）。在基于突变得分的ROC曲线分析中，AUC值为0.79（95%CI：0.71～0.87；图3D），灵敏度为59%（95%CI：0.45～0.71），特异性为99%（95%CI：0.96～1.00；图3B和C）。

 

此外，研究者还分析了HCC检测模型对于不同分期HCC的检测性能。为此，将训练和验证队列合并用于ROC曲线分析。分析发现，0期、A期、B期和C期的HCC的AUC值分别为0.88（95%CI：0.70～1.00）、0.95（95%CI：0.92～0.98）、0.94（95%CI：0.87～1.00）和0.99（95%CI：0.98～1.00），所有分期HCC检测AUC为0.95（95%CI：0.92～0.98；图3H）。灵敏度方面，0期、A期、B期和C期的灵敏度分别为86%（95%CI：0.42～1.00）、91%（95%CI：0.83～0.96）、93%（95%CI：0.76～0.99）和100%（95%CI：0.40～1.00），所有分期HCC检测灵敏度为92%（95%CI：0.85～0.96），特异性为95%（95%CI：0.91～0.97）（图3B和I）。

 

 

研究结果提示，训练集（MCP、突变和甲基化的AUC值分别为0.96、0.80和0.90）和验证集（MCP、突变和甲基化的AUC值分别为0.93、0.79和0.78）中，突变-甲基化联合的AUC值均高于单个组学维度的检测（图3A和D）。联合突变-甲基化标志物的检测灵敏度（训练队列为93%，验证队列为90%）均高于单个组学维度（图3C和J）。这些结果都提示了，突变和甲基化标记物的联合分析可以检测出更多的HCC病例，提高诊断的灵敏度。

 

此外，研究者还将基于MCP的突变-甲基化联合诊断模型与甲胎蛋白（AFP）这一HCC最常用的血液生物标志物进行性能对比（图3E）。结果显示，AFP对于0期、A期、B期和C期和所有分期的检测灵敏度分别为43%（95%CI：0.10～0.82）、53%（95%CI：0.42～0.64）、61%（95%CI：0.41～0.78）、25%（95%CI：0.10～0.81）和53%（95%CI：0.44～0.63）。这些发现表明，基于MCP技术的HCC检测模型的性能优于AFP。

 

图3.HCC检测模型的性能

（引自发表文章）

 

 

MCP的突变-甲基化平行分析性能使其能够直接比较同一cfDNA样本中的突变和甲基化改变，这在以前的研究中没有报告过。研究者分析了甲基化和突变信号均为阳性的个体中突变与甲基化频率之间的相关性。结果表明，两者之间无显著相关性（R=0.44，P=3.7×10-2；图4A）。在HCC患者中，分析显示甲基化频率远高于突变频率（图4B）。甚至在非HCC样本中一些甲基化位点的甲基化频率也高于HCC患者中的突变频率（图4C）。这些结果表明，在cfDNA样品中存在比突变高得多的甲基化噪音，一些甲基化的cfDNA可能来自癌组织、癌旁组织和正常组织中的非肿瘤细胞。

 

图4.同一cfDNA样本中突变和甲基化的比较

（引自发表文章）

 

 

最后，研究团队将HCC检测模型用于311例甲胎蛋白（AFP）/B超（US）阴性的HBV携带者，结果显示，该HCC检测模型实现了80%的灵敏度，94%的特异度和18%的阳性预测值（表1）。

 

 

大多数癌症无创活检研究受限于cfDNA的含量仅能关注一种类型的生物标志物。在本研究中，我们开发了MCP技术，该技术在单个MCP前文库中能保存突变和甲基化变化信息，以支持下游不同应用中的多项检测，包括对突变和甲基化变化进行平行分析，以及对新的甲基化生物标志物的发现等。在多数研究面临的cfDNA样本有限的情况下，MCP技术可不牺牲灵敏度且实现对单个样本的多重检测，非常适用于癌症液体活检领域的研究和应用。

 

参考文献：

 

Wang P，Song Q，Ren J，et al.Simultaneous analysis of mutations and methylations in circulating cell-free DNA for hepatocellular carcinoma detection.Sci Transl Med.2022 Nov 23;14(672):eabp8704.