编者按：多年来，关于RNA的研究一直很火热，其中小干扰RNA（siRNA）作为一种干扰目的基因表达的RNA，常用来进行靶基因的沉默。遗憾的是，siRNA技术的应用目前只停留在实验室阶段，并未进行临床应用，Preparative Biochemistry and Biotechnology杂志近期发表了一篇关于siRNA应用于喉癌临床诊疗中的研究，为该技术的临床转化提供了新思路。

 

喉癌（laryngeal cancer）是头颈部肿瘤最常见的亚型，喉癌的治疗通常依赖于手术及放化疗。然而，手术切除会产生较多并发症，而放化疗都存在特异性差，副作用高的缺点。ASH2L、CK2及Cyclin D1是喉癌发生发展的关键基因，通过抑制这些基因可有效的抑制喉癌细胞的增殖扩散，小干扰RNA（siRNA）作为一种沉默目标基因的工具，多年来在实验室中广为应用，该方法具有特异性好，有效性高的优点。但是在实验中，如果没有合适的载体，siRNA很快会被降解，并且很难被靶细胞所摄取，达不到治疗效果，因此限制了在临床中的应用。基于白蛋白的纳米颗粒（NP）已在生物医学方面应用多年，这些纳米颗粒无毒并可在机体内长时间存在。丝胶蛋白极性较强，易与其他蛋白相互交联，并可据研究目的而对其进行修饰，因此其可用于需要长时间存在血液循环的高稳定性载体系统。来自土耳其的Eda等学者使用白蛋白-丝胶纳米颗粒构建siRNA转运的载体，并装载透明质酸（HA）增强吸附，在细胞实验中验证了该载体转运siRNA的有效性，为未来siRNA治疗应用于临床开辟思路。

 

Alb-Ser NPs的制备：通过去溶剂化方法合成不同比例（1:1，1:2和2:1 w/w）的Alb NP，Ser NP和它们的共混物。NPs的物理和化学特性检验：使用Zeta-sizer记录样品的粒度分布和zeta电位(动态光散射方法，DLS)。使用扫描电镜观察NP的形态。使用衰减全反射-傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）（Nicolet iS10）及差示扫描量热法/热重分析（DSC/TGA）测量NP的化学特征。通过比浊分析法进行体外降解试验，研究NP的pH依赖性降解。HA/PLL-siRNA/Alb-Ser NP的制备：首先制备ASH2L、CK2和Cyclin D1基因的特异性siRNA。将siRNA储备溶液加入到阳离子聚合物PLL溶液中，经室温孵育2小时后将该溶液加入置备好的NP溶液中，搅拌过夜后，通过离心和洗涤收集附着PLL-siRNA的NP。最后使用HA溶液与上述取得的PLL-siRNA/Alb-Ser NP溶液一起旋转孵育，经离心后取得HA/PLL-siRNA/Alb-Ser NP。siRNA包封率（EE）测定：使用Quant-iT RiboGreen Assay Kit测定最终样品中的siRNA，从初始siRNA总量和终末样品中未结合的siRNA的量之间的差值计算EE。细胞培养和转染：从ATCC获得Hep-2喉癌细胞，使用EMEM培养基+10%胎牛血清+双抗进行培养。转染时，先将siRNA样品在无血清和不含青霉素 - 链霉素的培养基中稀释，然后将HA / PLL-siRNA / Alb-Ser（2:1）NPs，siRNA-HiPerFect和裸siRNA转染细胞4小时，转染后进行细胞毒性、RT-PCR及流AnnexinV流式细胞术凋亡分析。

 

 

1. NPs的流体动力学大小，zeta电位和形态特征。通过去溶剂化法成功合成了Alb，Ser，Alb-Ser（1:1），Alb-Ser（2:1）和Alb-Ser（1:2）NPs。用Alb-Ser NPs（2:1）制剂获得最小尺寸117 nm。PDI值（多分散指数）在0.015和0.162之间证实所有NP均匀，在水溶液中没有任何聚集。电位分析提示所有纳米颗粒均带负电。经扫描电镜观察，所有的NP均为球形。

 

 

2. ATR-FTIR和DSC / TGA。Alb-Ser（2:1）NP具有最大水平的C-H伸缩峰，说明其具有更强的红外活性振动。DSC / TGA分析提示具有2:1比例的混合NP具有更高的热容量和更高的分解温度。

 

 

3. siRNA EE的测定（％）提示随着包封siRNA含量的提高，EE值降低，但是包封的siRNA总量升高。当使用的siRNA的量分别为0.7125，1.425，2.85和5.7μg时，计算包封值61.3，48.5，40和36.8％。

 

4. 细胞毒性测定：靶向siRNAs的NPs的ASH2L，CK2和细胞周期蛋白D1分别具有浓度依赖性细胞毒性。使用HiPerFect作为siRNA载体，裸ASH2L，CK2和Cyclin D1 siRNA的最高量（5.7μg）的细胞毒性（％）为13％，16％和11％，而使用HA / PLL / Alb-Ser（2:1）NPs作为siRNA载体时，其毒性为71％，74％和43％。本研究构建的载体可显著提高siRNA的细胞毒性（P＜0.05）。

 

5. RT-PCR测定。通过测定靶细胞中相应基因的表达量，比较NP纳米载体与Hiperfect对siRNA的转运效能。结果证实二者均表现出相似的基因沉默性能，说明NPs能有效地向喉癌细胞转染siRNA。

 

6. AnnexinV-PI凋亡分析。使用HA / PLL / Alb-Ser（2:1）NPs进行转染，凋亡率为77.2和87.3％（抑制ASH2L和CK2基因），而使用裸siRNA处理的细胞（使用更高的siRNA量，5.7μg），其凋亡率为14.1%和17.7%。

 

 

 

使用新型Alb-Ser混合NPs作为载体能够有效的转染喉癌细胞。通过敲除与喉癌发病相关的基因，该方法能显著降低喉癌细胞活性，增加喉癌细胞凋亡。该方法最大的特点是构建的载体水溶性好，降解较少，有潜力将来在活体实验中使用，为siRNA的临床应用提供了新思路。

 

参考文献：

Yalcin E， Kara G， Celik E， et al. Preparation and characterization of novel albumin-sericin nanoparticles as siRNA delivery vehicle for laryngeal cancer treatment[J]. Preparative Biochemistry and Biotechnology， 2019: 1-12.