2020年11月7~8日，由北京大学医学部主办，中国研究型医院学会/分子诊断专委会、中国医药生物技术协会/合成生物技术分会、解放军总医院第五医学中心、欧美同学会医师协会/肝胆外科专委会共同承办的“第四届肝胆肿瘤及传染病精准诊疗国际论坛”在首都北京隆重举办。在肝胆肿瘤精准诊疗主会场上，美国梅奥诊所消化与肝病科Lewis Roberts教授和NCI终身高级研究员Xinwei Wang教授进行了精彩演讲，分别报告了“胆管癌的分子分型进展”和“病毒暴露特征可望用于早期肝癌的监测和诊断”，现将主要内容整理如下，以飨读者。

 

 

Lewis Roberts教授

 

Lewis Roberts教授报告了胆管癌分子分型的研究进展，组织遗传学分型兼顾了胆管癌的组织病理学特征和分子特征，具有更好的代表性，与患者的预后独立相关。

 

根据肿瘤发生位置，可以将胆管癌（CCA）分为肝内胆管癌（iCCA）、肝门部胆管癌（pCCA）和远端胆管癌（dCCA）；根据组织病理学，可以将iCCA分为胆小管型（Cholangiolar type）和胆管型（Bile duct type）。

 

诸如肝细胞癌（HCC）和胰腺导管腺癌（PDAC）等肝胆肿瘤都常见DNA突变的发生，TERT和TP53基因突变常发生于HCC，FGFR2和IDH基因突变常发生于iCCA，KRAS在HCC中的突变频率最低，而在PDAC中的突变频率最高。根据DNA突变水平、mRNA水平、基因组拷贝数变异水平和基因组甲基化水平等特征，可以对CCA进行分子分型。

 

CCA存在很大的基因异质性，根据不同信号通路的基因突变，可以对CCA进行分型，诸如以IDH基因为代表的NADPH代谢通路异常CCA，FGFR2融合为代表的FGFR信号异常CCA等；在mRNA水平上，可以将CCA分为具有FGFR2突变/融合、IDH突变以及二者之外的第三种亚型；根据基因组拷贝数变异，可以将CCA分为非典型亚型（Quiet atypical）、基因组混乱亚型（Genomically messy）、染色体不稳定亚型（Chromosomally unstable）和CCND1扩增亚型（CCNA1 amplified），其中，非典型亚型很少发生染色体不稳定突变，基因组混乱亚型常见基因突变，FGFR2融合比例较高，染色体不稳定亚型常伴有第6q、第9和第14染色体的缺失突变，CCND1扩增型则以CCND1扩增为典型特征；根据基因组的不同甲基化特征，可将CCA分为四类，其中，第四类的甲基化明显受到IDH突变的影响。

 

以上各种分子分型仅考虑了CCA的某种分子特征，均不能兼顾其他分型标准。充分结合基因突变、mRNA水平、基因拷贝数变异和甲基化水平等因素，可以将CCA系统地分为ECC型、IDH型、METH2型和METH3型，与以上各种分子分型相比，该分型方法更具有代表性。

 

Hippo信号通路效应分子YAP作为致癌基因，存在于多数CCA，在小鼠模型中，验证了YAP的致癌性。此外，应用FGF抑制剂，可以有效抑制YAP活性，从而阻止CCA进展。

 

免疫微环境对于肿瘤的发生和发展，具有重要影响。然而，CCA的免疫微环境非常复杂，关于免疫抑制占优势的骨髓细胞（如肿瘤相关巨噬细胞）、免疫检查点抑制剂单药治疗的效果以及骨髓细胞和适应性免疫细胞之间的相互作用机制等，需要进一步研究。

 

研究发现，将SB细胞接种于PD-L1-/-小鼠，无法形成肿瘤，表明宿主PD-L1的表达对肿瘤形成至关重要。此外，在小鼠和人的CCA中，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophage，TAM）的PD-L1表达量较其他细胞高出很多，表明TAM是PD-L1的重要来源。

 

综合CCA的组织病理学和基因组特征，进一步提出组织遗传学（histo-genetic）的分型方法（图1），兼顾了胆管癌的组织病理特征和分子特征，具有更好的代表性。

 

根据组织遗传学分型，可以将肝内胆管癌分为A、B两个亚型。对DSMC和Mayo两个队列进行研究发现，胆小管型肝内胆管癌主要分布于A亚型，而胆管型肝内胆管癌主要分布于B亚型，证明该分型方法支持组织病理学的分型结果。

 

图1.  肝内胆管癌的组织遗传学分型包括更多的病理学和遗传学特征

 

基于以上组织遗传学分型，对两个队列的患者进行生存分析表明，A亚型肝内胆管癌患者的预后显著优于B亚型患者（图2），将两个队列的数据进行合并分析，得出一致结论（图3）。

 

图2.  A亚型肝内胆管癌患者的预后优于B亚型

 

图3.  根据组织遗传学分型进行的合并生存分析

 

此外，组织遗传学A、B亚型与代谢相关信号通路、KRAS信号通路等一些特定的通路存在一定的相关性。多变量分析表明，B亚型胆管癌与患者的预后较差独立相关（图4）。

 

图4.  B亚型肝内胆管癌与预后较差独立相关

 

FGFR2融合表现为Hippo-YAP信号通路激活，肿瘤相关巨噬细胞对胆管癌患者的肿瘤进展非常重要。组织病理学或组织遗传学的分型系统，对于了解肿瘤的生物学过程和药物应答机制，具有重要意义，A亚型肝内胆管癌患者的预后显著优于B亚型患者。合作研究是未来胆管癌研究的一大趋势。

 

Xinwei Wang教授

 

提高早期肝细胞癌（HCC）的诊断率，及时采取治愈性的治疗措施，可以显著改善患者的预后。Xinwei Wang教授介绍了HCC异质性的研究进展，病毒暴露导致HCC的发生和进化，据此开发的病毒暴露特征（viral exposure signature，VES）检测，可望用于早期HCC的监测和诊断。

 

肝癌、食管癌、胰腺癌、肺癌等多数实体瘤患者的5年生存率低于20%，而急性淋巴细胞白血病（ALL）等液体瘤患者的5年生存率则通常高达90%。液体瘤患者的预后显著优于实体瘤患者，可能与液体瘤细胞的一致性相对较高有关，也就是说，实体瘤细胞具有“群落”的特征，而液体瘤细胞具有“独居”的特征。

 

肝癌是高度异质性的肿瘤，其异质性源于病因学和基因突变。病因学的异质性包括临床特征（肿瘤大小、数目、分期、转移情况以及合并肥胖等）、人口统计学特征（性别、年龄和种族等）、环境（HBV、HCV等病毒感染、接触黄曲霉毒素等化学致癌物、微生物或寄生虫感染等）以及生活方式（吸烟、饮酒、饮食因素等）差异。肝癌存在“驱动/可诉（driver/actionable）”突变以及成千上万的“乘客（passenger）”突变，肝癌患者可诉突变的比例较低，很难发现特征性的基因突变。

 

不同地域居民的肝癌发生率存在很大差异，诸如蒙古地区居民的年龄标化肝癌发生率是中国的近5倍，然而，不同地区肝癌患者的基因突变特征相似。根据肝癌患者的基因突变特征，可以分为MO1、MO2、MO3和MO4等亚组，每个亚组都有独特的转录图谱和驱动基因突变。进一步研究表明，MO1和MO2亚组肝癌的恶性度较低，而MO3和MO4亚组肝癌的恶性度较高。然而，对亚洲肝癌患者的研究发现，MO1和MO4亚组相对稳定，而MO2和MO3亚组相对不稳定。因此，基因亚组分型并不能很好地用于指导HCC的精准治疗。

 

对HCC基因组和转录组数据进行比较研究，发现肿瘤内异质性（intratumor heterogeneity）通常与染色体不稳定性、p53突变和患者生存期有关。

 

因此，肝癌是一种动态变化的疾病，包含不同的临床亚型和分子亚型，每种分子亚型具有相似的肿瘤转录图谱和独特的驱动突变，这些因素组成了肿瘤内异质性。然而，每个病灶包含数百万个肿瘤细胞，不同细胞有不同的分子特征，从而导致了复杂的肿瘤内异质性。这种异质性为肿瘤细胞提供了适宜的生存环境，但是，却大大增加了肿瘤标志物开发的难度。

 

单细胞分析是一种比较成熟的方法，可以用于定义肿瘤的生态系统，有助于更好地理解肿瘤细胞群的异质性，确定其中的主要细胞类型，理解细胞之间的相互作用和空间关系。一项研究中，研究人员将37例Ⅳ期肝癌患者的癌组织分离成单个细胞，进行scRNA测序分析，发现肿瘤细胞具有高度异质性，肝内胆管癌（iCCA）细胞的生物多样性远高于HCC细胞，肿瘤细胞生物多样性较低患者的治疗效果更好。

 

研究人员对肿瘤细胞的克隆性、进化与患者预后的相关性进行评估，发现肿瘤细胞克隆性较低患者的预后较好，此外，治疗5周后，患者肿瘤细胞的克隆性发生了明显改变，这可能也是肿瘤细胞进化的驱动因素。

 

肝癌精准医疗所面临的主要挑战包括病因异质性（环境、临床、生活方式、人口统计学因素）、肿瘤细胞不断进化（基因和表观遗传学的变化）以及分子方面的难题（尚无通用的生物标志物，导致监测和诊断失败，由于分子靶标变化，导致治疗失败）。

 

早期检出肝癌后及时治疗，能够大幅提高治疗成功率。然而，单独使用超声检查，对诊断早期HCC的敏感性较低，并不能显著改善患者的预后。

 

持续存在病毒，导致肝癌的发生和进化。病毒通过与宿主细胞相互作用，导致肿瘤发生后，继续不断进化，影响肿瘤突变细胞的形态和分子特征，从而不断改变与宿主细胞相互作用的模式，挑战宿主细胞的免疫识别能力。所以，病毒暴露是肝癌发生的最早源头，病毒暴露检测可望成为早期肝癌的生物标志物（图5）。

 

图5. 病毒暴露史定义早期肝癌的发生

 

研究人员对1072例患者进行了长达20年的随访研究，对病毒暴露特征（Viral exposure signature，VES）和HCC早期发生的相关性进行评估。有44例存在VES的患者发生HCC，通过Phage-IP-seq检测，分析病毒特征单核苷酸多态性（SNPs）（图6）。

 

图6.  病毒暴露特征和HCC早期发生相关性的研究策略

 

应用机器学习策略，确定HCC特异的最佳VES，发现VES包含61个病毒株，其中18个病毒株在HCC中高表达，HCC组和对照组的病毒特征预测评分存在显著差异（图7）。

 

图7. 鉴定VES与HCC的相关性

 

利用美国国立卫生研究院（NIH）国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK）队列的数据，对VES和HCC的相关性进行验证研究，结果表明，在诊断HCC之前和诊断HCC时，VES对HCC的预测性能均显著优于甲胎蛋白（AFP），在诊断之前，对HCC的预测性能也优于丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肝硬化状态和血小板计数等临床变量（图8）。纵向评估研究表明，在基线和诊断时，HCC患者都具有较高的VES评分，证实VES是可靠且稳定的HCC预测指标（图9）。

 

图8. NIDDK数据库验证VES用于监测早期HCC的有效性

 

图9. 纵向评估VES用于监测早期HCC的可靠性

 

通过对1072例患者的宿主病毒感染图谱进行抗原表位解析研究，表明病毒暴露史可预测高危人群的HCC发生风险，在临床诊断前，应用病毒暴露特征（VES）可以预测HCC的发生，优于AFP的预测性能，有必要进行大样本的前瞻性研究，进一步评估VES用于监测早期HCC的价值。